粪便DNA提取实验是一种用于从粪便样本中提取基因组DNA的实验技术,这对于研究肠道微生物组、疾病诊断和环境监测等领域具有重要意义。该实验的主要目的是从粪便样本中提取高质量的基因组DNA,以便进行后续的分子生物学分析,如PCR、测序等,但不同提取方法对DNA的纯度和产量有不同的影响。下面我们就一起来了解一下粪便DNA提取实验的难点及不同提取方法的比较。
一、粪便DNA提取实验的难点
l 杂质去除困难:粪便样本中含有多种可溶性杂质,如胆红素、胆汁盐、腐殖酸、植物源性多糖等。这些杂质难以洗涤和去除,从而导致提取的DNA纯度低。
l DNA得率低:粪便样本中脱落细胞较少,微生物含量较低,某些样本中还存在细胞壁较厚的革兰氏阳性菌,裂解不充分或洗脱不充分,都可能导致提取的DNA得率低。
l PCR等抑制因子的影响:粪便样品中含有的多聚糖、植物多糖、胆酸、胆盐、胆色素、消化液、粘液等均为酶学反应的抑制物,均会对Taq酶等的活性产生影响,从而影响到粪便DNA的下游检测。
二、不同粪便DNA提取方法的比较
和普通的组织细胞核酸提取不同,粪便样本本身的复杂性给DNA提取实验带来了较大难点,如果研究者无法获得高质量的DNA,即纯度和得率缺一不可的DNA,则无法顺利进行后续实验,因此,我们采用目前最常见的Trizol法和柱提法分别进行粪便DNA的提取,柱提法选用了市面上三款试剂,分别是国内知名公司N的粪便DNA提取试剂盒、Qiagen QIAampDNA Mini Kit以及BIOG粪便DNA提取试剂盒,目的是想从中找到最适合进行粪便DNA提取实验的方法和试剂。
我们准备了4份相同的粪便样本,每份重量200mg,分别使用上述方法及试剂进行DNA的提取,实验结果如下所示:
1、琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖凝胶电泳可对提取的粪便DNA质量进行检测,以便更好的评估DNA的完整性与大小。我们用等量洗脱液(40uL)对四份样本的粪便DNA进行了洗脱,分别取5uL DNA水溶液和1uL 6×Loading buffer混合均匀,进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图所示,四组提取的粪便DNA大小较为一致,其中Trizol提取的粪便DNA条带是最亮的,可能是由于提取到的DNA量较高的原因,但同时条带也出现了弥散和降解的情况,其它三款试剂提取的DNA样品则均为清晰规整的单一条带,且没有出现弥散或降解,Qiagen和BIOG的条带比品牌N的要更亮一些,提示提取的DNA浓度要更高一些。
2、DNA浓度与纯度检测
对粪便DNA浓度与纯度的检测对于后续进行PCR、荧光定量PCR、DNA重组等分子生物学实验来说是必要的。我们使用紫外分光光度仪对4份提取的DNA样本进行了0D260、0D280的检测,根据0D260计算DNA浓度及 0D260/0D280比值检测DNA纯度。结果如下表所示:从DNA浓度来看,Trizol法提取的最高,为190.25ng/uL;BIOG和Qiagen的次之,分别为162.34ng/uL和159.45ng/uL;品牌N提取的DNA浓度最低。从DNA纯度上来看,OD260/OD280比值应在1.7-1.9之间,根据这个标准,BIOG和Qiagen试剂盒提取的粪便DNA纯度均达标,品牌N提取的DNA样本中略有杂质,而Trizol提取的DNA纯度仅有1.32,较不理想。
*每组实验洗脱液体积均为40uL。
综合上述实验结果,我们发现常用的Trizol法虽然提取的粪便DNA浓度高,但是DNA的质量并不过关,实验过程中难以避免发生DNA降解的情况;同时,由于操作过程中很难完全去除杂质,因此导致提取的DNA纯度也不理想,很可能存在PCR抑制物,对后续涉及到酶学反应的实验会存在很大干扰。如果没有较大把握的研究者,不建议选择该种方法,最好还是选择柱提法试剂盒来提取,如BIOG粪便DNA提取试剂盒和Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit。无论是从提取的DNA样本质量来看,还是从提取的浓度和纯度来看,两者均有优异的表现,说明两款试剂盒内一是具备了强裂解能力的裂解液和消化液,能够充分裂解粪便样本,消化核酸外部的蛋白,使得DNA被充分释放,进而提高了DNA的提取得率;二是两者具备了洗杂能力较强的洗涤液,哪怕是对于粪便这种存在吲哚、酚类、蛋白质等杂质多而复杂的样本,也能将这些污染去除干净,保证了提取的DNA纯度,也更有利于进行后续的PCR相关实验。